MAKALAH_HIBRIDISASI DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwan Swiss  yang menamainya nuclein berdasarkan lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap peranan DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan ditemukannya postulat genetika dianggap dua molekul yang paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori tersebut.

“Perkembangan sains memperjelas bahwa makhluk hidup memiliki struktur yang luar biasa kompleks dan suatu keteraturan yang terlalu sempurna untuk muncul melalui peristiwa kebetulan. Ini membuktikan fakta bahwa makhluk hidup diciptakan oleh Pencipta yang Mahakuasa yang memiliki pengetahuan tanpa banding. Baru-baru ini, misalnya, dengan tersingkapnya struktur sempurna dalam gen manusia yang menjadi isu yang menonjol karena Projek Genom, penciptaan yang unik dari Tuhan telah terungkap sekali lagi untuk kita semua. Dari AS hingga Cina, ilmuwan dari seluruh penjuru dunia telah memberikan upaya terbaik mereka untuk menguraikan 3 miliar huruf kimiawi di dalam DNA dan menentukan urutannya. Sebagai hasilnya, 85% dari data yang terkandung dalam DNA manusia dapat diurutkan dengan tepat. Walaupun ini merupakan perkembangan yang sangat menarik dan penting, sebagaimana dinyatakan Dr. Francis Collins, pimpinan Projek Genom Manusia, sebegitu jauh ini baru langkah pertama dalam upaya menguraikan informasi di dalam DNA.”

1.2  Tujuan

• Untuk memahami Hibridisasi
• Untuk mengetahui tahapan hibridisasi
• Untuk mengetahui factor – factor yang mempengaruhi hibridisasi baik internal maupun eksternal
• Untuk mengetahui tanda keberhasilan hibridisasi

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.

Pengujian sel bakteri pembawa rekombinan, gen-gen target, level mRNA, hasil pemotongan ER (RFLP) dan uji lainnya yang  menggunakan teknik hibridisasi, membutuhkan proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti filter nitroselulosa. Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. Keadaan tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyakan diagnostik mikrobiologi yang memiliki konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. Probe dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara sintetik. Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai tunggal atau fragmen RNA yang dilabel.

Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut ‘Southern blotting’, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu  E.M. Southern (1975).  Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan.  Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat.  Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal.  Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.

Untuk identifikasi bakteri atau sel inang yang membawa plasmid rekombinan juga dilakukan hibridisasi dengan menggunakan membran nitrosellulosa yang meiliki ukuran dan bentuk sesuai dengan petridish yang digunakan. Membran ditempel ke medium LB yang telah ditumbuhi koloni bakteri, kemudian membrane diambil dan petri berisi koloni bakteri diinkubasi lagi untuk ditumbuhkan kembali. Kemudian membran diinkubasi bersama probe DNA Bila antara probe dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi.  Bila probe yang digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi.

Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyai stringency yang tinggi (highly stringent), maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau non homolog.  Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal homolog diantara beribu-ribu atau bahkan berjuta-juta  fragmen yang bermigrasi sepanjang gel.   Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membran yang telah mengalami hibridisasi pada film. Ada berbagai cara untuk memperoleh dari melabel probe asam nukleat. Sebuah gen dan agen penyakit yang akan dideteksi harus dimurnikan terlebih dahulu, kemudian dilabel apakah dengan radioisotop seperti 32P atau dengan substansi non-radioisotop. Walaupun substansi non-radioisotop dan dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Sensitifitas uji diagnostik menggunakan probe yang dilabel dengan non-radioisotop dapat ditingkatkan dengan penggunaan PCR. Substansi non-radioisotop yang paling sering digunakan sebagai label adalah biotin dan digoxigenin.

BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Hibridisasi dari DNA menggunakan Southern Blotting

Jika kita mempunyai DNA utas ganda dan dupisahkan menjadi utas tunggal kemudian dicampur sebelumya didinginkan dan ditempelkan kembali. Jika terdapat molekul DNA yang original yang mempunyai sekuen yang mirip. Utas tunggal dari berbagai banyak bangian dengan utas lawannya dari berbagai DNA molekul. Lawan itu diketahui sebagai proses hibridisasi dan dapat digunakan utuk menentukan berbagai sekuen, dipisahkan sampel yang berhubungan dari DNA dan RNA. Percobaan hibridisasi, yang diartikan digunakan untuk megetahui sekuen DNA atau gen yang digunakan untuk memilih sampel atau memilih DNA yang mirip.melekul probe Southern blot  digunakan untuk menentukan hubungan DNA dengan DNA yang lainnya dari berbgai sumber.

Teknik ini diikuti dengan membentuk molekul DNA berpasangan melalui pencampuran DNA dari berbagai sumber. Analisis ini menggunakan dua komponen, Probe  (berisikan sekuen dari gen yang menarik) dan DNA target (berasalkan dari berbagai organism). Sourthern dimulai dengan isolasi DNA target, DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan enzim restriksi, dan potongan DNA divisualisasi kedalam elektroforesis. Hasil elektroforesis direndam kedalam larutan asam pekat, yag bertujuan untuk memecah ikatan ganda DNA menjadi utas tunggal. Melalui prinsip kalilaritas, DNA dalam gel dipindahkan kedalam membrane.

Gambar 1. Capilaritas, Transfer DNA dari Gel ke Membran.

DNA utas tunggal dari sebuah gel akan dipindahkan ke membrane. Pada kertas filter menempel pada buffer dari tank, membawa gel dan membrane dan sampai ke kertas towel, DNA utas tunggal juka mengantarkan dari gel dan tongkat untuk membrane. Berat diatas menekan membrane dan gel menyentuh dan membantu DNA gel ke membrane.

Kemudian, probe dipersiapkan. Pertama, mengetahui sekuen atau gen harus diisolasi dan ditandai disalahsatu sisi (penanda menggunakan radioaktif, atau alkaline phosphatase). Mengidentidfikasi gen yang sekarang telah menjadi mudah bahawa banyak genom sudah diketahui urutan sekuennya. Probe dapat dibuat sekuen oligonukleotida yang unik dan diatur hanya untuk gen yang kita targetkan. Jika prob yang digunakan berisikan ologinuklotida yang umum maka probe akan menempel disembarang tempat.

Bagaimanapun juga oligonukleotidan yang digunakan probe aruslah panjang dan hanya menempel pada satu tempat, sepesifik tempat didalam suatu target genom. Probe dipersiapkan untuk shorthorn, mereka ditandai menggunakan radio aktiv, biotin atau digoxigenin. Akhirnya pelabelan DNA didenaturasi pada suhu tinggi untuk membuat utas tunggal. Analisis ini untuk dapat berhasil maka probe dan DNA utas ganda diinkubasikan pada temperature yang diikuti perkawinan utas DNA untuk membentuk tetapi diikuti jumlah yang rendah dari ketidak cocokkan. Toleransi suhu dan  ketidak cocokan, kemudian berhubungan berbagai jenis  bagaimana mencari kesepesifikan. Jika probe ditempeli dengan radioaktif bahwa membrane divisualisasi ke X ray.

 

Gambar 2. Molekul DNA dikawinkan dengan probe dapar untuk menditeksi yang

                           dihubungkan dengan sekuen didalam southern blot.

Southern bloting digunakan target untuk fragemt yang kecil dan run diagarose gel. Fragment dideaturasi secara kimia untuk membawa utas tunggal dan dipindahkan ke membrane nylon. Sebuah probe radioaktif diinkubasikan dengan membrane pada temperature untuk mengikuti hibridisasi untuk membentuk. Sejak di filemkan photografik adalah ditempatkan dibagian atas membrane, lokasi dari hibridisasi radioaktiv melekul adalah relevan. Probe juga dapat ditempeli dengan biotin atau digoxigenin pada membrane dalam fisualisasi digunakan chemiluminescent  untuk menditeksi probe dan divisualisasi di x ray. Band hitam pada filem sehingga dapat diketahui posisi fragment dengan sekuen yang mirip dengan probe. Alternatifnya, label biotin dan digoxigenin kemungkinan divisualisasikan melalui perlakuan dengan sebuah substrad chromogenic. Hasil visualisasinya band nya biru akan dibentuk secara langsung dimembran pada posisi sekuen yang berhubungan.

3.2 Northern Blotting

Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu: pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon dan diinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan biotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau substrad kromegenic.

Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah dilakukan hanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Sepertihalnya sourthern blot DNA harus dibuat utas tuggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka filem akan berwarna hitam. Dot blot sangat mudah dan cepat untuk menentukan sampel target yang berhubungan dengan sekuen sebelum dilakukan percobaan sesungguhnya.

Gambar 3. Dot Blot.

BAB IV

KESIMPULAN

Mendel dan genetika klasik

Ilmu genetika modern jejak akarnya ke Johann Gregor Mendel, seorang biarawan Jerman-CekoAugustinus dan ilmuwan yang mempelajari sifat warisan dalam tanaman. Dalam makalahnya "Versucheüber Pflanzenhybriden" ("Percobaan pada Tanaman Hibridisasi"), disajikan pada tahun 1865ke''''Naturforschender Verein (Masyarakat untuk Penelitian di Alam) di Brunn, Mendel menelusuri polawarisan sifat tertentu pada tanaman kacang dan menggambarkan mereka secara matematis. Meskipunpola pewarisan hanya bisa diamati untuk beberapa sifat, karya Mendel menunjukkan bahwa faktorketurunan itu partikulat, bukan diperoleh, dan bahwa pola-pola warisan banyak sifat dapat dijelaskanmelalui aturan-aturan sederhana dan rasio.Pentingnya kerja Mendel tidak mendapatkan pemahaman yang luas sampai tahun 1890, setelahkematiannya, ketika ilmuwan lain bekerja pada masalah yang sama ditemukan kembali penelitiannya.William Bateson, pendukung kerja Mendel, menciptakan kata''''genetika pada tahun 1905. Pada tahun 1910, Thomas Hunt Morgan berpendapat bahwa genberada pada kromosom, berdasarkan pengamatan dari mutasi mata terkait-seks putih di lalat buah. Padatahun 1913, Alfred muridnya Sturtevant menggunakan fenomena hubungan genetik untuk menunjukkanbahwa gen disusun secara linear dalam kromosom.

Genetika molekuler

Meskipun gen yang diketahui ada pada kromosom, kromosom terdiri dari kedua protein dan DNA parailmuwan tidak tahu mana yang bertanggung jawab untuk warisan. Pada tahun 1928, Frederick Griffithmenemukan fenomena transformasi (lihat eksperimen Griffith): bakteri mati bisa transfer material genetik untuk "mentransformasikan" bakteri yang masih hidup lainnya. Enam belas tahun kemudian, pada tahun1944, Oswald Avery Theodore, Colin McLeod dan Maclyn McCarty mengidentifikasi molekul yangbertanggung jawab untuk transformasi sebagai DNA. Percobaan Hershey-Chase pada tahun 1952 jugamenunjukkan bahwa DNA (bukan protein) merupakan bahan genetik dari virus yang menginfeksi bakteri,memberikan bukti lebih lanjut bahwa DNA adalah molekul bertanggung jawab untuk warisan.

DAFTAR PUSTAKA

Ø  http://biotecedu.blogspot.com/2011/03/hibridisasi-dari-dna-menggunakan.html / di akses pada tgl 2juni 2012

Ø  http://riessya.wordpress.com/2009/04/26/pemotongan-dna-dengan-enzim-endonuklease/ di akses pada tgl 2 juni 2012

Ø  http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/perpus-gen/  di akses pada tgl 25 mei 2012

Ø  http://www.docstoc.com/docs/37698071/DETEKSI-HIBRIDISASI-DALAM-BIOSENSOR-DNA-ELEKTROKIMIA / di akses pada tgl 2 juni 2012