ISOLASI DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam ilmu Hereditas, yaitu ilmu tentang pewarisan sifat-sifat fisik, biokimia dan perilaku dari suatu makhluk hidup kepada keturunannya. Sifat-sifat menurun ini dikendalikan oleh substansi genetika yang disebut DNA (Deoxyribo Nucleic Acid = Asam Deoksribo Nukleat), yang terdapat di dalam gen. Gen terkandung di dalam kromosom, yang terletak di dalam inti sel.

Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya (Corkill dan Rapey, 2008)

Saat ini kita dapat menemukan berbagai macam metode ektraksi DNA. Para peneliti selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau mengurangi jumlah perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan terlalu kompleks sering meningkatkan resiko kegagalan, terutama bagi pemula. Tahapan atau perlakuan dalam ekstraksi DNA juga dipengaruhi asal sel/jaringan target (Epplen dan Lubjuhn, 1998).

1.2  Tujuan

      Untuk mengetahui proses pelaksanaan ekstraksi DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi DNA

DNA biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah ini biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim DNase). Idealnya dinding sel (jika ada) didigesti secara enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin.

Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien, sehingga kerja enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 4 ⁰C, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-autoclave (fungsi autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat atau larutan tersebut). Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase kontaminan (RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau campuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. Setelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian bawah dan bagian aqueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. Cairan aqueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi material yang terlihat pada lapisan tengah.

Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung protein ini dicampur dengan dua bagian etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. Setelah dipusingkan, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali (Epplen dan Lubjuhn, 1998).

Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai berikut (Corkill dan Rapey, 2008):

a)    homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 4 ⁰C, semua bahan dan peralatan steril)

b)    lisis seluler (dengan detergen atau lisosim)

c)    penambahan chelating agents: EDTA/sitrat

d)    penambahan proteinase (proteinase K)

e)    ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)

f)     presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol)

g)    pelarutan kembali DNA, misalnya dengan bufer TE (Tris-EDTA)

DNA juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel virus. Untuk ekstraksi DNA semacam ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau virus tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi DNA-nya karena isolasi DNA target dari campuran DNA (DNA total) relatif sulit. Jika dibutuhkan isolat DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA dapat dimurnikan dengan density gradient centrifugation menggunakan CsCl (Caesium chloride) (Corkill dan Rapey, 2008).

2.2 Gen dan Kromoson

a)      Gen

Gen adalah bagian kromosom atau salah satu kesatuan kimia (DNA) dalam kromosom, yaitu dalam lokus yang mengendalikan ciri genetis suatu makhluk hidup. Gen diwariskan oleh satu individu kepada keturunannya melalui suatu proses reproduksi. Dengan demikian, informasi yang menjaga keutuhan bentuk dan fungsi kehidupan suatu organisme dapat terjaga. Gen terdapat berpasangan dalam satu lokus pada kromosom homolog. masing-masing gen dalam pasangan itu disebut alel. Kedua alel dapat membawa ciri sifat yang sama atau berbeda, misalnya sifat tangkai panjang da tangkai pendek.

b)      Kromosom

Kromosom adalah pembawa gen yang terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan protein. Kromosom homolog (2n) adalah kromosom yang terdapat berpasangan dan memiliki struktur dan komposisi yang sama. sel yang memiliki 2n kromosom (kromosom homolog) disebut sel diploid. Bila tidak berpasangan kromosom diberi simbol n kromosom. Sel dengan n kromosom adalah sel haploid, misalnya sel kelamin jantan saja atau sel kelamin betina saja.

BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Proses Isolasi DNA

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan itu berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan itu juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan yang lain yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein.

Gambar : Metode Isolasi DNA Sederhana

Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar.

Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

3.2  Bentuk-Bentuk Isolasi pada DNA

a)      Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

b)      Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

c)      Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA.

3.3 Ekstrasi/isolasi pada makhluk hidup

Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.

Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.

Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.

v  Pada manusia

Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette.

BAB IV

KESIMPULAN

Perbedaan DNA dan RNA

Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994) :

1)      Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa.

2)      Bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal   yang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda.

3)      RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.

4)      Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.

* Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:

o 1. Isolasi jaringan

o 2. Dinding dan membran sel dilisiskan

o 3. Diekstraksi dalam larutan

o 4. Dipurifikasi

o 5. Dipresipitasi

DAFTAR PUSTAKA

Ø  www.The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA./di akses pada tgl 24 mei 2012

Ø  http/www.Epplen, J.E., dan T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin. di akses pada tgl 24 mei 2012

Ø  www.Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology).Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada. di akses pada tgl 24 mei 2012